神經(jīng)生長因子(NGF)對交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元系統(tǒng)的發(fā)育和維持至關(guān)重要。NGF已被證實是一種復(fù)合物,由名為α、β和γ亞基的三種多肽組成。其中,亞基,β-NGF,是一種26.9kDa的蛋白質(zhì),含有241個殘基,參與神經(jīng)元的存活和分化。此外,β-NGF還是TRKA受體的配體,而 TRKA 受體是痛覺和溫覺神經(jīng)元分化和發(fā)育所的。
標記:
1.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500:1的比例混合,制成2×EdU標記培養(yǎng)基。
2.提前將2×EdU標記培養(yǎng)基預(yù)熱,然后將150微升2×EdU標記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合,獲得1×EdU溶液。
【注】:
①不建議替換全部培養(yǎng)基,這樣可能會影響細胞增殖的速度。
②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配,用量以沒過細胞為宜。
3.孵育細胞2h,棄培養(yǎng)基。
【注】:
①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)。
②大多數(shù)腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2h的孵育時間。
4.以1xPBS清洗細胞兩次,每次5min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。
【注】:
對于貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。
實驗步驟:
1.將細胞以104-105個細胞/孔的密度接種在96孔板中,加入100μL培養(yǎng)基,含或不含待測化合物。在CO2培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)細胞24小時。
2.向板中加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。
3.在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當時間(如6、12、24或48小時)。
4.向板的每個孔中加入10μL CCK-8溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5.將平板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。
6.在讀板之前,在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7.使用酶標儀測量450nm處的吸光度。